Как да реконституирате пептиди: ръководство стъпка по стъпка с калкулатор

Как да реконституирате пептиди правилно е първата контролна точка за качество във всеки предклиничен работен процес с пептиди. Аритметиката е проста, но малки отклонения на тази стъпка се пренасят във всяко последващо измерване. Това ръководство превежда лабораторните изследователи през протокол за реконституция в шест стъпки за лиофилизирани изследователски пептиди, съчетава го с безплатен калкулатор за реконституция на CertaPeptides и предоставя референтна таблица с типични обеми бактериостатична вода за осем често използвани изследователски пептида. Всички процедури, описани тук, са само за изследователски цели.

Накратко: Използвайте бактериостатична вода (0.9% бензилов алкохол), никога стерилен физиологичен разтвор. Изчислете обема вода с формулата количество пептид (mg) / целева концентрация (mg/ml). Инжектирайте разтворителя бавно по стената на флакона. Завъртайте леко, не използвайте вортекс. Етикетирайте веднага. Съхранявайте при 2 до 8 градуса C за работни запаси (до 28 дни) или разделете на аликвоти и замразете при -20 градуса C за архивно съхранение. Само за предклинична, in vitro и употреба в животински модели.

Честите грешки при реконституция, които правят предклиничните изследователски данни невалидни, включват използване на стерилна вода вместо бактериостатична вода (микробно замърсяване в рамките на 24 часа след първото пробиване), смесване с вортекс (което въвежда въздушни мехурчета и може да денатурира пептидни връзки чрез срязващо напрежение) и използване на етикетното количество без проверка на съдържанието на пептид, което посочва доклад за партидата на Вашия флакон. Този протокол разглежда систематично всяка от тези грешки и е подходящ за in vitro анализи и работни процеси за изследвания в животински модели.

Какво ще Ви е необходимо

Преди да започнете, съберете всички материали на работното си място. Когато всичко е подръка, времето за работа се свежда до минимум и се намалява рискът от замърсяване по време на процедурата. Работете в чиста лабораторна среда, в идеалния случай близо до HEPA-филтриран ламинарен бокс, ако Вашето съоръжение разполага с такъв.

• Флакон с лиофилизиран пептид – изсушеният чрез замразяване лиофилизат в запечатания му стерилен флакон, както е получен от доставчика.
• Бактериостатична вода (BW) – 0.9% бензилов алкохол във вода за инжекции. Не обикновена стерилна вода, не физиологичен разтвор.
• Прецизни спринцовки – вместимост 1 ml с игла 27 до 30 G за измерване с нисък мъртъв обем. Спринцовки от инсулинов тип са стандартни в изследователските работни процеси.
• Тампони с алкохол – тампони със 70% изопропилов алкохол за дезинфекция на гумени септи.
• Стерилни флакони за съхранение – предпочита се кехлибарено стъкло за защита от светлина, ако прехвърляте реконституирания разтвор в аликвоти.
• Перманентен маркер или етикетна лента – за незабавно етикетиране след реконституция с име на пептида, концентрация и дата на реконституция.
• Сертификат за анализ (COA) – за проверка на измереното съдържание на пептид, което отчита, когато отчита такова, преди изчисляване на обема.

Протокол за реконституция стъпка по стъпка

Стъпка 1 – изчислете целевата концентрация

Преди да докоснете флакона, направете изчисленията. Основната формула за реконституция е обем на BW (ml) = маса на пептида (mg) / целева концентрация (mg/ml). Процентът HPLC чистота не е корекционен коефициент: той е делът на основния пик от площта на откритите пикове, а не делът от масата на флакона. Когато доклад за партидата на Вашия флакон посочва съдържанието на пептид в mg на флакон, използвайте тази стойност за количеството пептид, като оценка за Вашия флакон.

Пример с изчисление. Флакон 5 mg BPC-157, целева концентрация 1 mg/ml. Необходим обем = 5 mg / 1 mg/ml = 5 ml бактериостатична вода. Запишете концентрацията на етикета; когато доклад за партидата на Вашия флакон посочва различно съдържание на пептид, изчислете вместо това с тази стойност.

Вместо да правите това на ръка всеки път, използвайте калкулатора по-долу. Въведете количеството пептид във флакона (когато доклад за партидата на Вашия флакон посочва съдържанието в mg на флакон, тази стойност е негова оценка), обема бактериостатична вода, който добавяте, и количеството, което искате за едно изтегляне; той дава концентрацията, обема за изтегляне и броя изтегляния от флакон. Добавете го в отметки – така се елиминира основен източник на отклонение в протокола при повтарящи се експерименти.

Безплатен инструмент:
Отворете калкулатора за реконституция на CertaPeptides
Въвеждате количеството във флакона, обема вода и количеството за едно изтегляне; получавате концентрацията, обема за изтегляне и броя изтегляния от флакон. Референция за предклинични изследвания.

Стъпка 2 – подгответе работната зона

Избършете старателно работната повърхност с нов тампон със 70% изопропилов алкохол. Оставете я да изсъхне напълно (приблизително 60 секунди), преди да поставите материали върху нея. Остатъчен алкохол, който влезе в контакт с пептида или разтворителя, може да разгради съединението и да въведе неконтролирана променлива във Вашето изследване.

Ако работите в споделена лаборатория, чиста хартиена кърпа или стерилна покривка под материалите Ви осигурява допълнителна бариера срещу замърсяване. Измийте ръцете си и, ако има налични, сложете нитрилни ръкавици. Целта е да се сведе до минимум времето, през което септите на флаконите са изложени на открит въздух по време на въвеждане на иглата. Ламинарният поток е идеален, но не е задължителен за малкомащабни изследователски реконституции.

Стъпка 3 – изтеглете бактериостатична вода

Почистете гумената септа на флакона с бактериостатична вода с нов тампон с алкохол. Оставете 30 до 60 секунди алкохолът да се изпари. Въведете иглата на спринцовката под лек ъгъл през центъра на септата – това намалява изрязването на частици от гумата. Обърнете флакона с BW, издърпайте буталото бавно до изчисления обем, след което извадете иглата. Проверете цилиндъра на спринцовката за въздушни мехурчета; ако има такива, почукайте леко и изтласкайте мехурчетата, преди да продължите.

Използвайте обема, който изчислихте в стъпка 1: ако е 2.0 ml, изтеглете 2.0 ml. Ако спринцовката Ви побира само 1 ml, разделете на две изтегляния – това е за предпочитане пред спринцовка с по-голям калибър, която въвежда по-голяма грешка от мъртвия обем. Последователността на метода за измерване е важна между експерименталните партиди, затова документирайте в бележките към протокола какъв тип спринцовка сте използвали.

Стъпка 4 – въведете разтворителя бавно по стената на флакона

Почистете гумената септа на флакона с лиофилизиран пептид с нов тампон с алкохол и я оставете да изсъхне. Въведете иглата бавно през септата и насочете върха така, че да сочи към вътрешната стъклена стена, а не право надолу към пептидната пита. Натискайте буталото много бавно, като оставяте бактериостатичната вода да се стича по стената на флакона и постепенно да контактува с лиофилизата отдолу нагоре.

Не насочвайте струята към пептидната пита. Високоскоростният удар на течността може да фрагментира лиофилизираната структура и да образува пяна. Пяната означава контакт на пептида с интерфейс въздух-вода, което ускорява окислението и може да денатурира крехки остатъци, особено при пептиди, съдържащи метионин, цистеин или триптофан (Manning et al., Pharm Res 2010, PMID 20143256). Техниката на бавно инжектиране по стената отнема допълнителни 20 до 30 секунди, но значимо запазва целостта на пептида. След като цялата BW е въведена, извадете иглата и изхвърлете спринцовката в контейнер за остри предмети.

Стъпка 5 – завъртайте леко до избистряне

Не използвайте вортекс. Не разклащайте. Поставете флакона между дланите си и го търкаляйте бавно напред-назад или го завъртайте леко в малки кръгове. Лиофилизатът ще започне да се хидратира и разтваря. Повечето пептиди стават напълно прозрачни в рамките на 2 до 5 минути при леко раздвижване. Някои амфипатични или дълговерижни пептиди (например TB-500 с 44 аминокиселини) може да изглеждат леко опалесцентни – това е нормално за този клас и само по себе си не показва разграждане.

Ако пептидът не се е разтворил след 10 минути леко търкаляне, не го насилвайте. Оставете го настрана при стайна температура за допълнителни 10 до 15 минути. Нагряване за ускоряване на разтварянето не се препоръчва – дори затопляне до телесна температура е достатъчно да ускори разграждането при чувствителни пептиди (Wang, Int J Pharm 1999, PMID 10460913). Ако след 30 минути остане видима утайка, проверете дали доставчикът дава указания за разтворител за конкретното съединение и дали използваният от Вас разтворител съответства на тях.

Стъпка 6 – етикетирайте и съхранете незабавно

След пълно разтваряне етикетирайте флакона, преди да направите каквото и да било друго. Напишете или залепете: име на пептида, концентрация (mg/ml), дата на реконституция и изчислен срок на годност (обикновено 4 седмици от датата на реконституция при съхранение на 2 до 8 градуса C с бактериостатична вода). Поставете в хладилник в рамките на минути – не оставяйте при стайна температура след реконституция. Поддържането на студена верига от този момент нататък е най-важният фактор за многоседмичната стабилност.

Ако разделяте в отделни флакони за съхранение за по-дългосрочно архивиране, прехвърлете незабавно с нова спринцовка и стерилна техника. Всеки флакон с аликвота получава същия етикет. Прехвърляйте бързо, за да сведете до минимум кумулативното излагане на въздух. За съхранение над 4 седмици замразете аликвоти за еднократна употреба при -18 до -20 градуса C (вижте раздела за съхранение по-долу). За изчерпателни насоки относно условията за дългосрочно съхранение вижте ръководството за съхранение на пептиди.

Референтна таблица за обеми при реконституция

Таблицата по-долу предоставя типични обеми бактериостатична вода за осем пептида в често срещани размери флакони. Това са начални референции, базирани на типични диапазони на концентрация в предклинични изследвания – използвайте калкулатора за реконституция на CertaPeptides, за да изчислите концентрацията и обема за изтегляне според количеството във Вашия флакон и избрания от Вас обем вода. Всички стойности са само като референция за лабораторни изследвания.

Пептид	Често срещан размер флакон	Препоръчана BAC вода	Крайна концентрация
BPC-157	5 mg	5 ml	1 mg/ml (1,000 mcg/ml)
TB-500 (Thymosin Beta-4)	5 mg	2 ml	2.5 mg/ml (2,500 mcg/ml)
GHK-Cu	50 mg	10 ml	5 mg/ml (5,000 mcg/ml)
Semaglutide	2 mg	2 ml	1 mg/ml (1,000 mcg/ml)
Tirzepatide	5 mg	2 ml	2.5 mg/ml (2,500 mcg/ml)
Retatrutide	5 mg	2 ml	2.5 mg/ml (2,500 mcg/ml)
Epitalon	10 mg	5 ml	2 mg/ml (2,000 mcg/ml)
Selank	5 mg	5 ml	1 mg/ml (1,000 mcg/ml)

Само референция за предклинични изследвания. Изборът на концентрация зависи от експерименталния дизайн, чувствителността на анализа и ограниченията в обема за съхранение. Консултирайте конкретния си изследователски протокол преди реконституиране.

Защо бактериостатична вода, а не стерилна вода

Както бактериостатичната вода (BW), така и стерилната вода за инжекции (SWFI) са стерилни към момента на производство. Разликата е какво се случва след първото пробиване на флакона. Стерилната вода не съдържа консервант – след пробиване на септата часовникът започва да тече. Всеки микроорганизъм, въведен чрез иглата или от околния въздух, може да започне да се размножава незабавно. За приложения за еднократна употреба, при които целият флакон се изразходва в една сесия, SWFI е технически приемлива. За изследователски флакони за многократна употреба тя не е практична.

Бактериостатичната вода съдържа 0.9% бензилов алкохол, широкоспектърен бактериостатичен консервант, който инхибира бактериалната и гъбичната пролиферация чрез нарушаване на мембраните (Manning et al., Pharm Res 2010, PMID 20143256). Това удължава безопасния период на употреба на реконституирания разтвор до приблизително 28 дни при съхранение на 2 до 8 градуса C, в сравнение с 24 часа или по-малко за SWFI. Тъй като повечето флакони с изследователски пептиди се изразходват в няколко сесии в рамките на дни или седмици, бактериостатичната вода е стандартният разтворител за реконституция за изследователска употреба. За пълен преглед на критериите за избор на разтворител, разтворимостта по клас пептиди и данните за срок на годност вижте пълното ръководство за бактериостатична вода.

Чести грешки при реконституция

Системното познаване на тези шест грешки ще защити целостта на предклиничните данни и ще намали загубата на проби:

• Вортекс или енергично разклащане. Създава пяна, въвежда интерфейси въздух-вода, които ускоряват окислението, и генерира срязващо напрежение, което може да фрагментира пептидни връзки. Винаги използвайте само леко завъртане.
• Използване на стерилна вода или физиологичен разтвор за флакони за многократна употреба. Стерилната вода няма антимикробна защита; физиологичният разтвор (0.9% NaCl) може да причини утаяване или агрегация при заредени или амфипатични пептиди. Използвайте бактериостатична вода за изследователски пептиди, които изискват съхранение за многократна употреба.
• Инжектиране директно върху лиофилизираната пита. Контактът с течност с висок удар раздробява крехката пореста структура на лиофилизата и насърчава образуването на пяна. Винаги насочвайте иглата към стената на флакона.
• Използване на етикетното количество без проверка на съдържанието. Съдържанието на пептид във флакона може да се различава от етикетното количество. Когато доклад за партидата на Вашия флакон посочва съдържанието на пептид в mg на флакон, използвайте тази стойност в изчислението като оценка за Вашия флакон (процент дава маса само при измерено брутно тегло на праха); стойността за HPLC чистота е дял от площта на откритите пикове, а не корекция за масата на пептида.
• Съхранение при стайна температура след реконституция. Реконституираните пептиди се разграждат бързо при околни температури. Повечето губят значителна активност в рамките на часове при 20 до 25 градуса C. Преместете в хладилник (2 до 8 градуса C) в рамките на минути след реконституция.
• Цикли замразяване-размразяване на една и съща аликвота. Повтарящите се цикли замразяване-размразяване причиняват увреждане от ледени кристали и прогресивно разграждане на пептида. Ако е необходимо дългосрочно съхранение, разделете на аликвоти за еднократна употреба преди първото замразяване. Вижте пълния списък с грешки при реконституция на пептиди с данни за въздействието на всяка.

Съхранение след реконституция

След реконституция разтворът на пептид е значително по-крехък от лиофилизирания си прекурсор. Три фактора движат разграждането: температура, светлина и замърсяване (Wang, Int J Pharm 1999, PMID 10460913). Управлението и на трите удължава използваемия срок на годност и запазва експерименталната последователност в многоседмични протоколи.

Температура. Съхранявайте при 2 до 8 градуса C за активни работни запаси с бактериостатична вода, максимум 28 дни. За по-дългосрочно архивиране замразете при -18 до -20 градуса C в аликвоти за еднократна употреба. Не съхранявайте във фризер без скреж (температурното циклиране по време на циклите на размразяване разгражда пептидите). Лимит на замразяване-размразяване: един цикъл. Разделете на аликвоти преди първото замразяване.

Светлина. UV лъчението и дори продължителното излагане на видима флуоресцентна светлина може да разруши пептидни връзки, особено при съединения, съдържащи ароматни остатъци (триптофан, фенилаланин, тирозин). Съхранявайте в кехлибарени стъклени флакони или обвийте прозрачните флакони с алуминиево фолио. Никога не оставяйте пептидни разтвори на работна маса в осветена лаборатория за продължителни периоди.

Замърсяване. Почиствайте септите с алкохол преди всяко въвеждане на игла, дори ако флаконът е бил в хладилник. Използвайте нова спринцовка за всяко изтегляне. Ако разтворът развие видима мътност, промяна в цвета или частици, които не са присъствали при реконституцията, изхвърлете го – не го използвайте в експерименти (Bogdanowich-Knipp et al., обзор на стабилността на пептиди в разтворители, PMID 10424348). За пълен основан на доказателства протокол за съхранение, обхващащ всички класове пептиди, вижте ръководството за съхранение на пептиди.

Често задавани въпроси

Каква вода да използвам за реконституиране на пептиди?

Бактериостатичната вода (BW) е стандартът за изследователски пептиди. Тя съдържа 0.9% бензилов алкохол като консервант, който инхибира микробния растеж и удължава срока на годност на реконституирания разтвор до приблизително 28 дни при 2 до 8 градуса C. Стерилната вода за инжекции е приемлива за приложения за еднократна употреба, но не предлага антимикробна защита за флакони за многократна употреба. Не използвайте чешмяна вода, дестилирана вода от нестерилен източник или обикновен физиологичен разтвор.

Колко дълго издържа реконституиран пептид в хладилник?

Реконституиран с бактериостатична вода и съхраняван при 2 до 8 градуса C: приблизително 28 дни за повечето пептиди. Реконституиран със стерилна вода: максимум 24 часа. Замразен при -18 до -20 градуса C в аликвоти за еднократна употреба: 3 до 6 месеца за повечето пептиди, макар че някои са стабилни до 12 месеца. Това са общи лабораторни насоки – стабилността варира според пептидната последователност, концентрацията и условията на съхранение. Винаги отбелязвайте датата на реконституция на етикета.

До каква концентрация трябва да реконституирам?

Концентрацията зависи изцяло от Вашия експериментален протокол, чувствителността на откриване на анализа и наличния обем за всяко изследователско приложение. По-високите концентрации изискват по-малки обеми за употреба (полезно при ограничаване на обема за дозировка в животински модели в предклинична работа), но намаляват общия обем на пробата. Използвайте калкулатора за реконституция на CertaPeptides, за да моделирате различни опции за концентрация спрямо размера на Вашия флакон и изследователските изисквания. Референтната таблица по-горе изброява често използвани начални концентрации за осем основни изследователски пептида.

Мога ли да използвам обикновен физиологичен разтвор за реконституция?

Физиологичният разтвор (0.9% разтвор на NaCl) обикновено не се препоръчва за реконституция на пептиди. Натриевият хлорид може да причини утаяване или агрегация при заредени или амфипатични пептиди. Физиологичният разтвор също не предлага антимикробна защита за съхранение за многократна употреба. Макар че някои специфични пептидни протоколи посочват изотоничен физиологичен разтвор за определени приложения, бактериостатичната вода е изборът по подразбиране за реконституция на изследователски пептиди поради съвместимостта си с най-широк диапазон съединения и консервиращите си свойства.

Трябва ли да филтрирам реконституирани пептидни разтвори?

Филтрация не е необходима за повечето предклинични изследователски приложения, ако се следва стерилна техника по време на реконституция и съхранение. Ако протоколът Ви изисква разтвори с ограничен ендотоксин или без частици (например определени in vivo проучвания в животински модели със строги контроли на инжекционния обем), обичайно се използва 0.22 микрона стерилен PES или PVDF филтър за спринцовка. PTFE филтрите трябва да се избягват за повечето пептиди поради неспецифично свързване, което може да намали ефективната концентрация. Винаги валидирайте възстановяването след филтриране с малък пилотен обем, преди да филтрирате целия запас.

Цялото съдържание по-горе се предоставя само за лабораторни изследователски цели. Тези материали не са за консумация от хора, медицинска диагноза или лечение. Изследователите трябва да следват SOPs за биобезопасност и работа със съединения на своята институция.