肽纯度测试的 HPLC 与质谱法：分析方法指南

⚠️仅用于研究目的 — 本文是为分析和实验目的使用肽试剂的合格实验室研究人员提供的技术参考。这不是医疗建议，作为示例讨论的肽严格用于实验室研究，不适用于人类或兽医用途。

简介

每个订购肽的研究实验室最终都会问同样的问题： 这到底有多纯粹？ 答案取决于分析证书 (COA)，通常以两个数字和两个色谱图形式表示：HPLC 纯度百分比和确认预期分子量的质谱。这两种技术—— 反相高效液相色谱法 和 质谱分析 — 是现代肽质量控制的支柱，它们共同回答了两个互补的问题：

• HPLC 告诉你多少 总肽含量是目标序列（纯度）。
• 质谱分析告诉你什么 该肽实际上是（同一性）。

单独使用这两种方法都不够。通过 HPLC 检测，肽的纯度可能为 99%，但序列错误。它可以具有完全正确的质谱，但含有 20% 的杂质，这些杂质在单个 HPLC 峰下共洗脱。良好的肽表征结合使用这两种方法，并且越来越多地使用混合技术，例如在同一台仪器上运行 HPLC 分离和质量检测的 LC-MS。

本文为想要实际阅读和解释 HPLC 和 MS 数据的研究人员提供了一份实用指南，而不仅仅是接受 COA 的表面价值。它涵盖：

• RP-HPLC 的工作原理以及“95% 纯度”的实际含义
• 肽的三种主要质谱分析格式：LC-MS/ESI、MALDI-TOF 和混合方法
• 如何在色谱图或光谱上发现常见杂质
• 何时使用哪种技术
• 运行和解释 QC 数据的实用技巧

1。为什么肽纯度很重要

对于简单的生物筛选，90% 纯度可能就足够了。对于结构活性研究、定量体外测定、晶体学或长期稳定性研究，杂质可能会扭曲您的实验结果，而事后几乎无法排除故障。

合成肽中的常见杂质包括：

• 删除序列：由于固相合成过程中偶联不完全而缺失一个或多个残基。
• 截断序列：因链过早终止而缩短的肽。
• 插入顺序：双重偶联产生的额外残留物。
• 不完全脱保护的肽：侧链或 N 末端保留保护基团（Trt、Pbf、tBu、Boc、Fmoc）。
• 氧化物种：+16 Da（Met、Trp、Cys 氧化）或 +32 Da（双重氧化）。
• 脱酰胺物种：Asn → Asp 或 Gln → Glu，+1 Da 转变。
• 阿斯巴酰亚胺副产物：在 Fmoc-SPPS 过程中，在 Asp-Gly、Asp-Ala、Asp-Ser 和 Asp-Thr 序列上形成环状酰亚胺。
• 外消旋残基：手性反转，通常在长时间碱处理下的 Cys、His 和 Ser 处。
• 树脂相关文物：痕量树脂接头片段仍然附着在肽上。

这些杂质中的每一种都具有特征特征。问题是你的分析方法能不能看到它。

格罗德等人。 (1992, DOI）描述了一种不寻常的合成假象：在对带有苄基型侧链保护基团（Tos、Bzl 和 Clz）的肽进行 HF 裂解时，这些基团迁移到肽的 N 末端 Fmoc 基团上，产生四种杂质，作者通过快原子轰击 MS 和 NMR 鉴定了这些杂质（PMID：1286938）。这是 HF/苄基型化学，不是现代 Fmoc/tBu 合成中使用的 TFA 裂解，但它显示了质谱法使杂质检测工作成为可能。

2。反相 HPLC：肽纯度的主力

它是如何运作的

反相高效液相色谱 (RP-HPLC) 在装有疏水性固定相（通常是用 C8 或 C18 烷基链官能化的二氧化硅）的柱上分离肽。水和有机改性剂（乙腈，有时是甲醇）的流动相混合物在高压下流过色谱柱。离子对剂——几乎总是 三氟乙酸（TFA） 0.05–0.1% v/v — 添加到两相中以控制肽电离并改善峰形。

分离原理：肽根据其疏水性在水性流动相和疏水性固定相之间分配。梯度从高百分比的水开始，逐渐增加到更高百分比的乙腈，以增加疏水性的顺序洗脱肽。疏水性更强的肽需要更高的有机百分比才能从 C18 固定相解吸。

210–220 nm 处的紫外检测器（监测肽主链酰胺键）测量随时间变化的吸光度，生成具有与每个洗脱物质相对应的峰的色谱图。

“HPLC 纯度为 220 nm”是什么意思

当 COA 上注明“通过 HPLC 在 220 nm 处测定的纯度≥98%”时，其含义是：

主峰至少占 220 nm 处总积分峰面积的 98%。

这是面积归一化百分比，而不是绝对质量百分比。一些注意事项：

• 吸光度取决于成分：在 220 nm 处，酰胺键是主要的发色团，响应大致与酰胺键的数量成正比，但芳香族残基（Trp、Tyr、Phe、His）会贡献额外的吸光度，从而扭曲相对响应。
• 共洗脱杂质是看不见的：如果缺失序列或非对映异构体与主峰共洗脱，则 HPLC 面积百分比会超出主峰。
• 波长很重要：220 nm 的纯度可能与 280 nm（强调芳香族残基）的纯度相差几个百分点。
• 不吸收紫外线的杂质是看不见的：盐、TFA、缓冲液残留物和一些小有机物在 220 nm 处不吸收，因此不计算在内。

因此，COA 上的数字是一种约定，而不是物理常数。两个不同的实验室使用不同的色谱柱和梯度可以报告相同肽的不同纯度百分比。最佳实践是在引用纯度值时始终指定色谱柱、梯度、波长和流速。

典型的肽 HPLC 方法

• 专栏：C18、4.6 × 150 mm、3.5 µm 或 5 µm 粒径（用于分析工作）； 250 mm 可获得更高的分辨率。
• 流动相A：0.1% TFA 水溶液。
• 流动相B：0.1% TFA 乙腈溶液。
• 渐变：在 20 分钟内从 5% B 变为 65% B，然后清洗 95% B。
• 流量：1 毫升/分钟。
• 检测：220 nm（初级），280 nm（芳香族交叉检查）。
• 注射：10–20 µL，约 1 mg/mL 肽溶液。
• 柱温：25–40 °C，受控。

涩江等人。 (2005, DOI）表明离子对试剂（磷酸、TFA、PFPA 或 HFBA）的类型和浓度显着改变肽 RP-HPLC（PMID：16013616）中的选择性和分辨率。因此，单一通用方法可能无法解决所有密切相关的物种，并且任何未解决的问题都将作为主峰的一部分进行整合。

读取色谱图

干净的肽色谱图显示单个尖锐、对称的主峰，其中：

• 良好的峰形：拖尾因子理想为 0.9–1.5。
• 主峰面积高：≥95% 通常用于研究级肽，≥98% 用于优质级。
• 没有大肩膀：肩部表明存在部分解析的杂质，通常是删除序列有一个氨基酸不同。
• 无延迟洗脱峰 进入洗涤液：可以指示疏水性聚集体或保护基加合物。
• 无早期洗脱峰：可以表示盐、亲水性副产物或裂解产物。

3。质谱分析：确认身份

核心测量

质谱法测量电离分子的质荷比 (m/z)。对于肽，这意味着确认分子量、检测质量转移杂质（例如 +16 Da 氧化），以及在 MS/MS 模式下通过断裂模式验证氨基酸序列。

三种质谱技术主导肽分析：

1. 电喷雾电离 (ESI)，通常与 HPLC 联用作为 LC-MS
2. 基质辅助激光解吸/电离 (MALDI)，与飞行时间耦合为 MALDI-TOF
3. 高分辨率液质联用仪 （Orbitrap、Q-TOF）用于精确质量测定

采用电喷雾电离的 LC-MS

在 ESI 中，HPLC 洗脱液在高压下通过狭窄的毛细管喷射。喷雾产生带电液滴，蒸发后产生气相肽离子。对于肽，ESI 通常会产生多电荷物质 - [M+H]⁺、[M+2H]2⁺、[M+3H]3⁺ 等 - 电荷态分布取决于肽的碱性残基和溶液 pH 值。

LC-MS/ESI 的优点：

• 在线HPLC分离 意味着每个峰都是单独表征的，因此共洗脱物质不再是看不见的。
• 高灵敏度：常规检测纳克到皮克的数量。
• 天然肽环境：软电离可保留完整的分子离子，并最大限度地减少碎片。
• 定量能力：选择离子监测 (SIM) 和多反应监测 (MRM) 可实现精确定量。

吴等人。 (2020, DOI）展示了使用液相色谱与高分辨率质谱联用对精氨酸加压素进行杂质鉴定和定量，说明 LC-MS 如何检测和鉴定标准 HPLC-UV 可能合并到主峰中的结构相似的合成杂质（PMID：32247289）。

读取质谱

一份好的肽 LC-MS 报告应包括：

• 提取离子色谱图 (XIC) 在预期的 [M+H]⁺ 或 [M+nH]ⁿ⁺ m/z。
• 主峰顶点处的质谱图，显示电荷状态包络。
• 解卷积中性质量，根据电荷态分布计算。
• 理论质量 的目标序列，用于比较。
• 质量准确度，以 Da 或百万分率 (ppm) 为单位的增量质量报告。对于高分辨率仪器，典型值为 <5 ppm；对于低分辨率仪器，<0.5 Da 很常见。

需要寻找的常见质量转移杂质特征：

• +16大：单氧化（通常为 Met、Trp 或 Cys）。
• +32大：二氧化。
• −17 Da：氨的损失，典型的 N 端 Gln 环化为pyroGlu。
• −18 Da：水分流失，常见于 Ser、Thr、Asp。
• +14大：甲基化或 Val/Leu 取代错误。
• +1大：Asn 或 Gln 或 Asp 的脱酰胺作用，导致 Asn 替换错误。
• 删除序列质量转移：−57 (Gly)、−71 (Ala)、−87 (Ser)、−97 (Pro)、−99 (Val)、−113 (Leu/Ile)、−128 (Gln/Lys)、−147 (Phe) 等

MALDI-TOF 质谱法

在基质辅助激光解吸/电离飞行时间 (MALDI-TOF) 中，肽与 UV 吸收基质共结晶（对于 3 kDa 以下的肽，通常为 α-氰基-4-羟基肉桂酸，对于较大的肽/蛋白质，通常为芥子酸）。脉冲紫外激光解吸并电离肽，主要产生单电荷 [M+H]⁺ 离子。离子通过规定的电压加速并穿过飞行管；通过校准将飞行时间转换为 m/z。

MALDI-TOF的优点：

• 简单快捷：分钟级样品制备，每个光谱数秒。
• 单次充电状态：无需电荷态反卷积即可更轻松地解释光谱。
• 对盐和缓冲液的耐受性：对样品清洁度的要求低于 ESI。
• 质量范围宽：在一台仪器上覆盖小肽到大蛋白质。

沙伯格和莫斯 (2008, DOI）描述了受保护的合成肽中间体的 MALDI 样品制备方法，旨在用于肽工艺开发中的反应监测、故障排除和质量控制（PMID：18295503）。

缺点：

• 对杂质的敏感性较低：基质的离子抑制可以隐藏相对强度 <1% 的微量杂质。
• 无内置分离：与 LC-MS 不同，它没有色谱分辨率——共存物质会竞争电离。
• 最多半定量：结晶点与点之间的差异意味着相对峰高不是可靠的定量指标。

由于这些原因，MALDI-TOF 通常用作已通过 HPLC 评估纯度的样品的身份确认工具，而不是作为独立的纯度方法。

高分辨率 MS（Orbitrap、Q-TOF）

高分辨率仪器可提供质量精度 <5 ppm and resolving power >30,000，从而能够：

• 精确质量确认 精度达到亚 ppm，排除相同标称质量的杂质。
• 同位素模式匹配，这是元素成分的诊断。
• MS/MS 序列验证 通过 CID、HCD 或 ETD 碎片。

对于绝对身份确定性至关重要的研究肽（晶体学、定量体外测定、SAR 研究），高分辨率 LC-MS 是黄金标准。

4。 HPLC 与质谱分析：对比

参数	反相高效液相色谱（紫外）	液质联用 (ESI)	飞行时间飞行时间
主要问题已回答	目标是多少？	每个组件是什么？	身份确认
分离	是（色谱）	是（色谱）	否
身份确认	否 — 仅保留时间	是的——分子质量	是的——分子质量
对微量杂质的敏感性	中等（仅限紫外可见光）	高（质量选择性）	较低（离子抑制）
定量？	是（面积%）	是（提取离子）	半定量
质量准确度	N/A	5–500 ppm 典型值	50–500 ppm 典型值
运行时间	每个样品的最小值 10–40	每个样品的最小值 10–40	每个样品的最小值 1–5
样品制备复杂性	低	低	低-中
对盐的耐受性	中等	低——需要易失性缓冲区	高
肽 QC 的典型用途	初级纯度指标	同一性+共洗脱分析	快速身份确认

何时使用每个

• 220 nm 的 RP-HPLC： 总是。它是一线纯度评估和 COA 声明的参考点。
• 液质联用：用于身份确认并验证主 HPLC 峰下没有隐藏任何内容。对于体外定量分析中使用的任何肽都是必不可少的。
• 飞行时间飞行时间：用于快速身份确认，特别是当批次需要快速检查时。 HPLC 的良好补充。
• 高分辨率质谱仪：当需要绝对同一性时——出版物、正式分析报告或杂质的确切身份很重要的研究。
• 氨基酸分析（AAA）：绝对定量肽含量的黄金标准 — 不是纯度技术，而是需要准确的“毫克肽”时的参考方法。
• 核磁共振：用于结构确认和鉴定质谱法不可见的立体化学问题（外消旋化、非对映体）。

5。实际实验室注意事项

阅读 COA

当您收到研究肽的分析证书时，请检查：

1. 序列：它与您订购的相符（一个字母或三个字母代码）吗？
2. 分子量：理论平均质量和单同位素质量。 MS 报告是否相符？
3. HPLC 纯度和条件：百分比+波长+柱+梯度。没有条件的数字是没有意义的。
4. 质谱数据：仪器、电离模式、观测质量与理论质量、质量精度。
5. 抗衡离子含量：大多数合成肽都是 TFA 盐，除非经过转化；实际肽含量通常为净重的 70–90%。
6. 残留水分：<5% 通常； <3% 较好。
7. 分析日期：肽即使在冻干形式下也会降解。最近的一项分析比两年前的分析提供了更多信息。

运行您自己的检查

如果您可以使用 HPLC，请务必对定量工作中使用的任何肽进行快速纯度检查：

• 将保留时间和峰模式与之前收到的批次或参考材料进行比较。
• 留意以前不存在的新峰值——与存储相关的退化指标。
• 记录每批的参考色谱图，以便将来进行比较。

对于 LC-MS 检查，对预期的 [M+H]⁺ 或 [M+2H]²⁺ 进行有针对性的监测通常足以确认身份；全扫描 MS 更适合发现杂质。

处理 TFA 反离子

大多数合成肽均以 TFA 盐形式提供。 TFA 与碱性残基（Arg、Lys、His）强烈离子对，并有助于增加净重。如果绝对肽含量很重要（就像任何定量测定一样），您必须：

• 进行氨基酸分析 以确定真实的肽含量。
• 使用含有肽的 COA 宣布。
• 转换成不同的盐形式 （例如乙酸盐或 HCl），需要进行离子交换或从适当的酸中反复冻干。

对于 TFA 敏感的测定（例如，痕量 TFA 可能干扰的某些基于细胞的测定），可能优选醋酸盐。

常见陷阱

• 进样量过多：超载的色谱柱会产生扭曲的峰形和不准确的面积百分比。按比例调整柱的进样量。
• 忽略洗涤阶段：一些杂质仅在高有机洗涤中洗脱。延长梯度或洗涤以捕获它们。
• 仅信任紫外线面积百分比：尽可能与 MS 结合使用。
• 不监控色谱柱：色谱柱性能随使用而降低；定期运行参考标准品以验证保留时间稳定性。

6。常见研究问题

Q1：我的肽经 HPLC 检测纯度为 98%，但质谱显示在 +16 Da 处有第二个峰。这是怎么回事？
几乎可以肯定，您有部分氧化，最有可能是蛋氨酸、色氨酸或半胱氨酸的氧化。氧化形式可能与主峰共洗脱或部分共洗脱，使其对 UV 不可见，但对 MS 可见。使用更长、更浅的 HPLC 梯度重新分析，尝试解析氧化物质，并检查储存条件 - 氧化通常是空气暴露或微量金属污染的迹象。

Q2：为什么不同的实验室报告的相同肽的纯度百分比不同？
因为“HPLC 纯度”是一个依赖于方法的数字。不同的色谱柱、梯度、波长和积分参数将产生不同的面积百分比。对同一材料运行不同方法的两个实验室可以合法地报告相差 1–3% 的百分比。直接比较的唯一方法就是使用相同的方法。

问题 3：LC-MS 总是比单独使用 HPLC 更好吗？
对于杂质检测和身份确认，是的。对于通过经过验证的方法进行纯定量纯度评估，HPLC-UV 仍然是药典标准。理想的工作流程是 HPLC-UV 检测百分比，LC-MS 检测身份和共洗脱。

Q4：如果质谱与预期质量不符怎么办？
首先检查常见修饰：未完全去除的保护基团（+56 tBu、+252 Pbf、+242 Trt、+272 Mmt、+100 Boc、+222 Fmoc）、氧化（+16、+32）、脱酰胺(+1)、水损失(-18)、氨损失(-17)。如果您无法解释质量变化，请联系供应商并请求重新分析批次。

Q5：我怎么知道我的专栏是否还好？
定期运行参考标准品并监测峰形、保留时间稳定性和塔板计数。保留时间漂移 >0.5 分钟、拖尾因子 >2 或可见的压力上升表明色谱柱降解。大多数分析 C18 色谱柱可为 500–2000 进样提供可靠的结果，具体取决于样品清洁度和流动相侵蚀性。

参考文献

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